HILIC in der Lebensmittelanalytik

Kürzlich wurde im Lebensmittelchemischen Institut (LCI) eine Methode zur chromatographischen Trennung von Imidazolen – heterozyklische aromatische Verbindungen, die z.B. in Zuckercouleur vorkommen – mittels HILIC etabliert.






Seit einigen Jahren werden in der Flüssigchromatographie/HPLC für ein breites Anwendungsgebiet vermehrt sogenannte HILIC-Trennphasen verwendet. Hierbei handelt es sich um eine spezielle Variante der Normalphasen(NP)-Chromatographie, deren Popularität lange Zeit durch die sogenannte Umkehrphasen(RP = Reversed Phase)-Chromatographie als abgelöst galt.
Das Akronym HILIC steht für „Hydrophilic interaction liquid chromatography“ und wurde erstmals 1990 von A.J. Alpert definiert, womit dieser ein alternatives chromatographisches Verfahren zur Trennung hochpolarer Verbindungen spezifizierte. Analog zur NP-Chromatographie finden bei der HILIC polare stationäre Phasen Anwendung, jedoch kommen anders als bei der NP-Chromatographie typische polare RP-Eluenten (wie Methanol, Acetonitril oder Wasser) zum Einsatz. Hierbei ist die Elutionsstärke invers zur RP, so dass Wasser die stärkste Elutionskraft besitzt.
Lange bevor sich die Bezeichnung HILIC in der Welt der Chromatographie durchsetzte, wurde von Samuelson und Sjöström eine erste HILIC-Applikation etabliert. Den Forschern gelang es 1952, Monosaccharide an einer Amberlite IRA Ionenaustauschsäule mit einen Elutionsgradienten aus Ethanol und Wasser zu trennen.
In den vergangenen Jahren gewann HILIC als Ergänzung zur RP immer weiter an Bedeutung. Insbesondere da die Bestimmung sehr polarer Analyten mit der RP aufgrund mangelnder Retention kaum oder gar nicht möglich ist.


Trennprinzip
Typisch für die hydrophile Interaktionschromatographie ist die Verwendung einer polaren stationären Phase, sowie eines Elutionsmittels, das sich aus einem wässrigen Puffersystem und einem organischen, in Wasser löslichen Modifier (bevorzugt Acetonitril) formiert. Ein Elutionsgradient in der HILIC beginnt meist mit einem hohen Acetonitril-Anteil (< 70 %) und endet mit einem hohen Anteil Wasser/Puffer in der mobilen Phase.
Die Trennung der Analyten basiert auf deren Hydrophilie bzw. Polarität. Das Trennprinzip hierbei ist noch nicht abschließend geklärt, indes wird davon ausgegangen, dass sich eine Wasser- bzw. Pufferschicht auf der polaren Oberfläche ausbildet und sich dabei Verteilungschromatographie zwischen Analyt und stationärer Phase ereignet. Dabei eluieren die Analyten in der Reihenfolge ansteigender Polarität, da die Retentionszeiten polarer und hydrophiler Verbindungen aufgrund größerer Interaktion mit der stationären Phase expandieren.
Da ferner auch andere Effekte und Wechselwirkungen beim Trennmodus von Bedeutung sind, führen unterschiedliche stationäre HILIC-Phasen in der Praxis auch zu unterschiedlichen Ergebnissen. Grundsätzlich werden HILIC-Phasen in drei Gruppen eingeteilt. Zum einen in die neutralen Phasen, wie beispielsweise Diolphasen, zum anderen in die geladenen Phasen (z.B. Silica- oder Aminophasen), sowie in die zwitterionischen Phasen, die sich durch gute Selektivität auszeichnen.


Anwendungsbeispiele
Ihre Anwendung in der Lebensmittelanalytik findet die HILIC beispielsweise bei der Analyse von Acrylamid, Methacrylamid und Methacrylsäure sowie der Trennung von wasserlöslichen Vitaminen wie Dehydroascorbinsäure/Ascorbinsäure, Panthenol oder Thiamin. Ferner wird dieses chromatographische Verfahren in der Rückstandsanalytik zur routinemäßigen Rückstandsbestimmung von Tierarzneimitten, Mastmitteln und Wachstumsregulatoren eingesetzt. Weiterführend sind auch die Analysen von organischen Säuren, Aminosäuren sowie Kohlenhydraten dokumentiert.